NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)

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2018-03-28

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产品描述:NovoRecPCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)是近岸蛋白质科技最新研发的专利产品。 该产品可以不依赖于连接酶,不受载体和目的片段的酶切位点限制,而直接用同源重组的方法,完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。 该技术操作简单,PCR产物一步定向克隆,目的片段与载体无缝连接,反应时间短至20分钟,阳性率达到95%以上,让您轻松完成实验。

使用方法:A.线性化载体的获得线性化载体可以通过两种方法获得,不管采取哪种方法,最终线性化载体的浓度需15ng/l。 (高浓度的载体有利于提高效率)。 1、酶切选取合适的位点,单酶切或双酶切皆可,并且5端突出,3端突出或平末端均适用本Kit。

2、PCR选取合适的位点,设计正向和反向引物,引物长度一般在18-20bp左右,一般载体长度均大于3kb,建议用高保真的聚合酶扩增(推荐使用NovoproteinpfuDNA聚合酶,货号:E002)。

为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响,建议载体酶切后再用PCR扩增,自连背景更低,阳性率更高。 B.目的片段获得目的片段通常通过PCR获得。

引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与线性化载体的两端一致,特殊应用引物设计请参照技术手册。 为保证PCR扩增的特异性及灵敏度,请尽可能选用pfu等高保真酶(推荐使用NovoproteinpfuDNA聚合酶,货号:E002)。 PCR每条引物长度至少在35-40bp,包括5端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp,(注意事项:如果是表达载体克隆构建,引物设计完全后,请注意检查读码框的正确)。 引物设计方法:使用NovoRecPCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)时,引物设计是很重要的,在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则,只不过上下游引物要加上15-18bp的载体同源序列。

载体同源序列如何添加主要分以下两种情况:(1)载体酶切后是5端突出或平末端,则引物上的同源序列包括5端突出部分的序列;(2)载体酶切后是3’端突出,则因无上的同源序列不包含突出部分。

(如下图,红色碱基为希望保留原有的酶切位点所额外添加的碱基,不计算在15bp之内。 注:15bp同源序列不要求严格从载体最末端一届碱基计算,这是载体末端非同源序列将会被删除,同时导致重组效率的下降。

当非同源序列达到20bp时,效率下降一半。 NovoRec一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)引物设计方法C.目的片段与载体的重组1.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反应2.混匀后在37℃放置20分钟;3.立即进行转化,剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。 (注意:1.目的片段与载体的摩尔比在3:1-10:1之间,摩尔比低于3:1效率会降低2.反应时间在20-40分钟,时间太长不利于重组反应)D.转化建议所使用的感受态细胞效率要达到或5X106cfu/冰上融化一管100l的DH5a感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来。

加入10l的反应液到感受态细胞中,轻弹数下,置冰上孵育45分钟。

℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。

3.加入500lSOC液体培养基,37℃孵育45-60分钟。

离心3分钟收集菌体,根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定一般的,我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用Novoprotein2xspecificTMMasterMix货号:E010)。

鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们建议一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目的片段特异性引物。

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1月9日报道台媒称,为反制解放军海军,发展不对称作战,台军方祭出狼群战术,拟筹建60艘45吨隐形微型导弹突击艇,由台湾中山科学研究院委制,台湾海军编列预算委托民间厂商建造,预计4年成军。据台湾《中国时报》1月8日报道,根据台湾中山科学研究院的邀商说明会内容指出,微型导弹突击艇的排水量满载约45吨、全长约米、全宽约米、吃水米、船速满载时最高航速35节以上。